1. Akt: Im Haus Eisensteins hört das Stubenmädchen Adele gerade eine Serenade Alfreds, eines alten Verehrers der Hausfrau Rosalinde („Täubchen, das enflattert ist“). Da sie eben eine Einladung ihrer Schwester Ida zu einem Ballfest im Haus des reichen Prinzen Orlofsky erhalten hat, spielt sie ihrer Herrin eine traurige Komödie von einer kranken Tante vor, für die sie einen freien Abend benötige. Rosalinde lehnt ab, weil ihr Gatte Gabriel noch am selben Abend eine fünftägige Arreststrafe wegen Beamtenbeleidigung antreten soll. 

Adele verlässt heulend das Zimmer, da tritt der schmachtende Tenor Alfred ein, dessen Stimme Rosalinde immer schon sehr beeindruckt hat. Er kann sie dazu veranlassen, ihn zu einem Stelldichein in der Wohnung einzuladen, sobald Eisenstein ins Gefängnis gegangen ist. Kaum ist er fröhlich weggegangen, kommt Eisenstein in Begleitung seines stotternden Advokaten Dr. Blind nach Hause. Er ist empört: Durch die Ungeschicklichkeit seines Verteidigers ist die Strafe auf acht Tage erhöht worden. Er wirft den aufgeregten Stotterer hinaus, bestellt bei Adele eine „Henkersmahlzeit“ und fordert Rosalinde auf, ihm das schäbigste alte Gewand für den Gefängnisaufenthalt vorzubereiten. 

Eisensteins alter Freund Dr. Falke erscheint, um ihn zu dem Ballfest bei Orlofsky einzuladen. Die anfänglichen Bedenken wegen des Strafantritts sind bald zerstreut. Als Rosalinde zurückkehrt, findet sie ihren Mann zu ihrem Erstaunen in bester Laune. Plötzlich kommt ihm in den Sinn, in eleganter Abendkleidung seine Haftstrafe antreten zu wollen, um sich „vom Gesindel dort zu unterscheiden“. Gutgelaunt verlässt Eisenstein nach rührendem Abschied das Haus. 

Adele hat wieder Grund zum Staunen, denn plötzlich erklärt ihre Herrin ihr, sie am heutigen Abend doch nicht mehr zu benötigen. Kaum hat Eisenstein das Haus verlassen, tritt auch schon Alfred ein, der nur auf diesen Augenblick gewartet hat. Er macht es sich sogleich gemütlich, wirft sich in den Schlafrock Eisensteins, bedient sich seiner Getränke und bezaubert die dadurch schon etwas ernüchterte Rosalinde wieder durch seinen Gesang („Trinke, Liebchen“). 

Plötzlich klingelt es – Gefängnisdirektor Frank kommt, um seinen noblen Häftling höchstpersönlich ins Gefängnis zu geleiten („Mein schönes großes Vogelhaus“). Rosalinde bleibt nichts anderes übrig, als Alfred als ihren Gemahl vorzustellen. Dieser wieder kann Rosalinde nicht kompromittieren und muss sich von Frank festnehmen lassen, nicht ohne zuvor noch die Situation zu einem zärtlichen Abschied von Rosalinde genutzt zu haben. 

2. Akt: Im Palais des Prinzen Orlofsky sind schon viele Gäste versammelt. Falke stellt Eisenstein unter dem Namen „Marquis Renard“ vor. Orlofsky fordert ihn auf, mit ihm zu trinken und macht klar, dass in seinem Haus den Gästen alles erlaubt sei, was gefalle (Couplet „Ich lade gern mir Gäste ein“). Adele ist im besten Kleid ihrer Herrin erschienen. Ihre Schwester hat sie als Schauspiel-Elevin eingeführt, dennoch wird sie von Eisenstein erkannt und spielt die Entrüstete, als er vor allen Leuten die Ähnlichkeit mit seinem Stubenmädchen erwähnt (Lied „Mein Herr Marquis“). Der Gefängnisdirektor Frank ist unter dem Namen „Chevalier Chagrin“ ebenfalls eingetroffen und befreundet sich bestens mit dem ihm nicht persönlich bekannten Eisenstein. 

Letztlich trifft, von Dr. Falke bestellt, auch Rosalinde maskiert in der Rolle einer ungarischen Gräfin ein (Csárdás „Klänge der Heimat“). Mit Erstaunen muss sie feststellen, dass ihr Gatte nicht im Gefängnis ist, sondern sich hier unterhält. Eisenstein findet sofort Gefallen an der schönen Maskierten und flirtet intensiv mit ihr, wobei es ihr gelingt, sich seiner Uhr zu bemächtigen und damit ein Beweisstück seines lockeren Verhaltens zu gewinnen (Duett „Dieser Anstand“). 

Nun versammeln sich alle zum Souper. Eisenstein erzählt in übermütiger Stimmung, wie er beim letzten Fasching seinem Freund Dr. Falke einen Streich gespielt hatte, indem er ihn nach einer durchtanzten Nacht im Kostüm einer Fledermaus dem Spott der Gassenjungen auf morgendlicher Straße ausgesetzt habe. Dr. Falke lächelt maliziös und meint dazu, es sei noch nicht aller Tage Abend. 

Das Fest geht weiter, und erst um Schlag sechs Uhr morgens drängen alle zum Aufbruch. Frank muss seinen Dienst im Gefängnis antreten, und Eisenstein sollte eigentlich schon bei ihm in der Zelle sitzen. 

3. Akt: Stark angeheitert kommt Direktor Frank in sein Amtszimmer, wo ihn der immer betrunkene Gefängnisaufseher Frosch empfängt. Frank schläft sogleich auf einem Sessel ein, wird aber bald wieder geweckt: Adele und Ida sind gekommen, weil das Stubenmädchen an ihrer Rolle als Schauspielerin Gefallen gefunden hat und durch das Vermittlung nun den „Chevalier Chagrin“ bitten will, ihre Ausbildung zu finanzieren. Kaum hat sie in einem Couplet eine Probe ihres Könnens abgelegt (Lied „Spiel ich die Unschuld vom Lande“), meldet sich Eisenstein, worauf Frosch die beiden Mädchen rasch in eine Zelle sperren muss. 

Frank und Eisenstein, beide noch in arger Katerstimmung, geben einander ihre wahre Identität zu erkennen. Eisenstein wird daraufhin plötzlich ernüchtert: Wer war der Mann, den Frank gestern in seiner Wohnung, in seinem Schlafrock wie er ihm genüsslich erzählte – verhaftet hat? Wie gerufen erscheint der Advokat Dr. Blind, um für den noch immer im Gefängnis sitzenden falschen Eisenstein zu intervenieren. Während Frank abgeht, nimmt Eisenstein dem verdutzten Dr. Blind die Perücke und seine Utensilien weg, drängt ihn hinaus und verkleidet sich als Advokat. Auch Rosalinde ist mittlerweile erschienen. 

Alfred wird vorgeführt und beide beschweren sich über den ungetreuen Gabriel, der die ganze Nacht im Kreise hübscher Damen verbrachte, und dem Rosalinde vor der Ehescheidung noch die Augen auskratzen wolle. Tobend vor Zorn und Eifersucht legt Eisenstein seine Maske ab und will eben ein Donnerwetter loslassen, als Rosalinde ihm seine Uhr als Beweisstück seiner Flatterhaftigkeit vorführt. 

Alle Mitwirkenden betreten das Gefängnis, Falke erklärt, dass er die ganze Sache nur inszeniert habe, um seine damalige Blamage als „Fledermaus“ zu rächen. Eisenstein aber bleibt nichts anderes übrig, als seine Rosalinde um Verzeihung zu bitten und seine Strafe anzutreten. Prinz Orlofsky will sich um Adeles Karriere kümmern, und alles löst sich in Wohlgefallen auf: Schuld war eben nur der Champagner.